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中华人民共和国进出口商品检验行业标准sn0175

2012-5-2 13:51:01  点击: 2734

中华人民共和国进出口商品检验行业标准

   出口食品小肠结肠炎耶尔森   SN 0174—92
         氏菌检验方法 代替   ZB X04 003—86
Method for detection of Yersinia
enterocciitica in food for export
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

1 主题内容与适用范围

  本标准规定了出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中小肠结肠炎耶尔森
氏菌(以下简称耶氏菌)检验方法。
  本标准适用于出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中耶氏菌检验。其他
食品可参照使用。
2 样品制备及增菌培养

2.1 如为冷冻食品,应于2~5℃下不超过18h解冻。若不能及时检验,应放于—15℃保存,
最多不能超过2 d。非冷冻易腐的食品应置于4℃冰箱保存,最多不得超过3d。
2.2 无菌操作称取剪碎后的样品25g(猪舌应剪取舌根、舌两侧及舌尖部肉),置于装有
225mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中,充分振荡(若采用均质,可将剪碎后的
样品25g置于灭菌均质杯内,加入25mL已灭菌的改良磷酸盐缓冲液,以8000~10000r/min
均质0.5min,再将均质好的样品置入装有200mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶
中,充分振荡),然后于25℃培养48±2h。吸取该培养液1mL移种于预先预热到25℃的装有
9mL的5g/L氢氧化钾溶液的试管中,使之充分混合0.5min。立即吸取该混合液2mL移种于
预先预热到25℃的装有8 mL的改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤的试管中,充分混合,于25
℃培养4~6h。

3 分离培养

3.1 将上述经改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤增菌的培养液摇匀,以直径3mm的接种环分
别挑取一环划线于表面无凝固水的含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板和含吐温80的麦康凯琼
脂平板各一个,培养于25℃,含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板培养3~4d,含吐温80的麦康凯
琼脂平板培养48±2h。
3.2 观察各琼脂平板,有无典型或可疑耶氏菌菌落。
  耶氏菌的菌落特征见表1:

表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌菌落特征 
琼脂平板
菌落类别
菌 落 特 征 
大小,mm
表 面
透明度
高 度
颜 色
边 缘
形状
含吐温80的麦康凯琼脂
A
1~1.5
粗糙, 有多层环状皱折
不透明
枕状,中心呈乳头状凸起
淡粉红色, 菌落周围绕有毛玻璃样淡粉红色晕
不整齐
圆形
B
1~1.5
光滑、湿润
半透明
扁 平
淡粉红色, 菌落周围绕有毛玻璃样淡粉红色晕
整 齐
圆形
C
1~3.0
光滑、湿润
半透明
扁 平
淡橙粉红色
有细微散射状皱折
圆形
D
1~1.5
粗糙, 有多层环状皱折
不透明
枕状、中心呈乳头状凸起
淡粉红色, 菌落周围培养基为透明淡蔷薇红色
不整齐
圆形
含吐温80的亚硫酸铋琼脂
E
针尖~ 3.0
光 滑
不透明
扁平或凸起
黑绿色或黑灰色至漆黑色,菌落周围培养基有时有黑绿色微粒弥漫
整 齐
圆形
F
2~3
粗糙, 有多层环状皱折
不透明
扁平, 有时中心呈乳头状凸起
灰绿色, 菌落周围绕有浅灰绿色或蓝绿色毛玻璃样晕
不整齐
圆形
4 鉴定
4.1 筛选试验
4.1.1 每种琼脂平板至少应挑取两个典型或可疑菌落,分别用光滑的接种针穿刺并密布
地接种于改良的克氏双糖铁琼脂各一管,于25℃培养24±2h。 
4.1.2 挑取菌落后的琼脂平板,应置于5~8℃至少保留24 h,以备必要时复查。
4.1.3 按表2试验结果进行判断。

      表2 改良的克氏双糖铁琼脂筛选小肠结肠炎耶尔森氏菌
改良的克氏双糖铁琼脂
初步判断
斜 面
底 层
产 气
硫化氢
A
A
-(+)
-
可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌
A
A
+
+
 非小肠结肠炎耶尔森氏菌
A
A
+
-
K
A
+
+
K
A
-
-
    注:K产碱,A产酸;+阳性反应;-阴性反应;(+)偶见少量小气泡。
4.2 生化试验
4.2.1 刮取一满环(直径3mm)符合表 2的典型或可疑耶氏菌特性的改良克氏双糖铁琼脂
斜面培养物,接种于装有1mL Rustigian氏尿素培养基(改良法)的10 mm×100 mm的试管
中,手摇或于电动快速混合器上振摇5~6s,然后于25℃培养,每隔半小时观察一次,培养观
察至4h。
4.2.2 将尿素酶试验阳性的改良克氏双糖铁琼脂斜面培养物按表3所列生化项目(尿素酶
试验除外)进行生化试验,培养于25℃,氨基酸脱羧酶试验培养24~30h,其他生化试验阴
性结果的应培养观察4d。

   表3 小肠结肠炎耶尔森氏菌生化反应与血清学试验结果判定 
生 化 反 应
血清学试验
结果判定
尿素酶试验
鸟氨酸脱羧酶试验
赖氨酸脱羧酶试验
蔗糖试验
山梨醇试验
L-阿拉伯糖试验
鼠李糖试 验
西蒙氏枸橼酸盐试验
+
+
-
+
+
+
-
-
"O"因子血清试验阳性
小肠结肠炎耶尔森氏菌( 典型 )
+
+
-
-
+
+
-
-
"O"因子血清试验阳性
小肠结肠炎耶尔森氏菌(非典型 )
+
-
-
-
-
+
-
-
"O"因子血清试验阳性
+
+
-
+
+
+
+
+
"O"因子血清试验阳性
+
+
-
+
+
+
+
-
"O"因子血清试验阳性
+
+
-
+
+
+
-
+
"O"因子血清试验阳性

注:+阳性反应;-阴性反应。 
4.2.3 观察生化反应结果,将符合表3耶氏菌特性的,按4.3进行血清学试验;如不符合
表3 所列生化反应,特别是尿素酶试验阴性或赖氨酸脱羧酶试验阳性为非小肠结肠炎耶
尔森氏菌。
4.3 血清学试验
  在洁净的载玻片上加一滴“O”因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混
浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5~1 min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显
的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无
自凝现象。
4.4 根据4.2和4.3试验结果,按照表3进行判定。
  如生化反应结果完全符合表3耶氏菌特性,但与所有“O”因子血清均不发生凝集反应
者,其菌落典型,镜检为革兰氏阴性、无芽胞小短杆菌,可按《Bergey氏细菌学鉴定手册》
最新版扩大必要的生化试验,判定为可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌,并送交上一级单位鉴定。
5 报告结果 
5.1 报告阳性结果:“检出小肠结肠炎耶尔森氏菌”。 
5.2 报告阴性结果:“未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌”。 
6 培养基 
6.1 改良的磷酸盐缓冲液 
  磷酸氢二钠                8.23g
  磷酸二氢钠(含1个结晶水)         1.20g
氯化钠                  5.00g
  山梨醇 10.00g
  胆盐(3号)                 1.50g
  蒸馏水 1000mL
  将前三种成分溶于水中,再加入后两种成分,溶解后调至pH7.6,分装于500mL广口玻
璃瓶内,每瓶225mL,高压灭菌121℃15min。
6.2 改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤(modified yeast extract-rose bengal broth)
6.2.1 基础液
  磷酸二氢钾 0.508g
  磷酸氢二钠 11.21g
  酵母浸汁                 5.00g
  氯化钠                  1.00g
  硫酸镁(含7个结晶水)          0.01g
  蒸馏水 770mL
  将上述各成分溶于蒸馏水中,加热使之完全溶解,调至pH8.0,121℃高压灭菌15min。
6.2.2 40 g/L山梨糖水溶液:100.00 mL。
6.2.3 10 g/L丙酮酸钠水溶液:100.00mL。
6.2.4 4g/L孟加拉红水溶液:10.00 mL。
6.2.2, 6.2.3溶液流通蒸汽加热0.5h灭菌,6.2.4溶液过滤除菌,将灭菌过的此三种
溶液加到灭菌、冷却的基础液中,调至最终pH为8.0,以无菌操作分装于18mm×180mm灭菌
的试管中,每管8mL,4℃冰箱保存备用。
6.3 含吐温80的麦康凯琼脂
  蛋白胨 12.00g
  (月示)蛋白胨(proteose peptone) 3.00g
  乳糖 10.00g
  胆盐(3号)               1.50g
  氯化钠                5.00g
  吐温80(Tween 80)           10.00g
  氯化钙(无水)             0.20g
  中性红 0.03g
  结晶紫 0.001g
  琼脂 18.00g
  蒸馏水 1000mL
  将琼脂于800mL蒸馏水中加热溶化,以50mL蒸馏水将吐温80稀释,再将其他各成分(指
示剂除外)加入150mL蒸馏水中,加热使之完全溶解。将后二种溶液加至已溶化的琼脂液
中,充分混匀, 调至pH7.1±0.2,再加入指示剂,混匀后121℃高压灭菌15min,待冷至50~
55℃时,立即倾注于灭菌平皿内,每皿约15 mL,制成的琼脂平板呈淡橙色。
6.4 含吐温80的亚硫酸铋琼脂
6.4.1 基础液
  牛肉膏                   5.00g
  蛋白胨 10.00g
  葡萄糖                   5.00g
  氯化钠                   5.00g
吐温8O(Tween 80)              10.00g
  氯化钙(无水)                0.20g
  琼脂 20.00g
  蒸馏水 1000mL
6.4.2 亚硫酸铋混合液
6.4.2.1 溶解200 g无水亚硫酸钠于1000 mL蒸馏水中,配成200 g/L水溶液。
6.4.2.2 溶解50 g枸橼酸铋铵于500 mL蒸馏水中,配成100g/L水溶液,加1mL浓的氢氧化
铵,放置至澄清,可能还需再加数毫升氢氧化铵。加此溶液于6.4.2.1溶液中并混合之。
6.4.2.3 加100 g无水磷酸氢二钠并混合之。
6.4.2.4 加10 g枸橼酸铁铵于100 mL蒸馏水中,配成100 g/L水溶液。并将此液加入上
述的6.4.2.1、6.4.2.2、6.4.2.3的混合液中。
  将混合液于100℃加热2 min或3 min,用橡皮塞塞瓶,储存于室温暗处,不可放于冰箱
内。
6.4.3 加70mL亚硫酸铋混合液于1000 mL经121℃灭菌15min并冷至70℃左右的基础液中,
彻底摇匀,再加4 mL 10g/L煌渌水溶液,混匀,待冷至50℃左右时倾注平皿。制成的平板
应为淡乳黄色、不透明,存放于室温暗处或冰箱内,以临用前一天制备为宜。
6.5 改良的克氏双糖铁琼脂
  牛肉膏                 3.00g
  酵母膏                 3.00g
  蛋白胨 15.00g
  (月示)蛋白胨              5.00g
  山梨醇 20.00g
  葡萄糖                 1.00g
  硫酸亚铁                0.20g
  氯化钠                 5.00g
  硫代硫酸钠           0.30g
  酚红                  0.024g
  琼脂 15.00g
  蒸馏水 1000mL
  以800mL蒸馏水将琼脂加热溶化,再用200mL蒸馏水将其他成分(酚红除外)加热溶解,
再将以上两种溶液混匀,调至pH7.4±0.2,然后加入酚红,分装于13mm×130mm试管,121℃
高压灭菌15min,待冷至50℃左右,斜置成深高层斜面。制成的培养基为淡橙红色。
  培养基采用高层穿刺、斜面密布划线接种法。25℃培养24±2h。观察结果:小肠结肠
炎耶尔森氏菌的反应为底层斜面均产酸、变黄色、无硫化氢、不产气(偶有少量小气泡)。
6.6 Rustigian氏尿素酶试验培养基(改良法)
6.6.1 基础成分
  酵母浸汁                0.10g
  磷酸二氢钾               0.091g
  磷酸氢二钠(无水)            0.095g
  酚红                  0.01g
  蒸馏水 900mL
  高压灭菌121℃ 15min
6.6.2 浓尿素液
尿素 20.00g
蒸馏水 100.00g
  过滤除菌
6.6.3 将上述两液混合,分装于10mm×100mm的灭菌试管中,每管约1 mL左右。制成的培
养基为淡橙黄色,尿素酶反应阳性者培养基由淡橙黄色变为桃红色,阴性者颜色不变。
6.7 鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验培养基
6.7.1 基础液
  蛋白胨                 5.00g
  牛肉膏                 5.00g
  溴甲酚紫(16 g/L)           0.625mL
  甲基红                2.50mL
  葡萄糖                 0.50g
  盐酸吡哆素(维生素B6,pyridoxine)    0.005g
  蒸馏水     1000mL
  调至pH6或6.5
6.7.2 基础液分成三等分,第一部分不加任何氨基酸,分装试管作对照用;第二部分按
10g/L加入L-赖氨酸双盐酸盐;第三部分按10g/L加入L-鸟氨酸双盐酸盐。若使用DL氨基
酸,应相应地于培养基中按2%浓度加入。加入氨基酸后应再调pH,然后分别分装于10mm
×100mm试管中,121℃高压灭菌10 min。
6.7.3 培养基接种后,应加一层液体石蜡(约10mm厚),于25℃培养24~30h。阳性反应者
为紫色或红紫色,弱阳性者为青灰色,阴性反应为黄色。
6.8 糖发酵培养基
6.8.1 糖发酵肉汤基础液
  蛋白胨          10.00g
  牛肉膏                3.00g
  氯化钠                5.00g
  Andrade氏指示剂 10.00g
  蒸馏水 1000mL
  调至pH7.1~7.2
6.8.2 蔗糖、山梨醇最终使用浓度为10g/L,可于灭菌前加入基础液中,分装试管,121℃
高压灭菌10min。L-阿拉伯糖和鼠李糖最终使用浓度为10g/L,应先配成100g/L水溶液,L-
阿拉伯糖水溶液流通蒸汽灭菌30min,鼠李糖水溶液121℃高压灭菌10min,然后分别以无
菌操作加入先经121℃高压灭菌15min的基础液中,无菌操作分装于已灭菌的13mm×130mm
试管中,每管3mL。
6.8.3 Andrade氏指示剂
  蒸馏水 100.0mL
  酸性复红               0.50g
  氢氧化钠(1.0moL/L)         16.00mL
  将酸性复红溶于蒸馏水中,并加入氢氧化钠,数小时后,如复红褪色不够,再加1 mL
或2mL氢氧化钠溶液,此试剂如保存时间较长则效果更好。
6.8.4 此培养基制成后近于无色,接种后于25℃培养24±2h,阴性反应应继续培养观察
4d。阳性反应为红色,阴性反应则颜色不变。
6.9 西蒙氏枸橼酸盐琼脂
  硫酸镁                0.20g
  氯化钠                5.00g
磷酸二氢按         1.00g
  磷酸氢二钾              1.00g
  枸橼酸钠               2.00g
  琼脂 20.00g
  蒸馏水 1000mL
  加1:500溴麝香草酚蓝指示剂溶液40mL,混匀,分装13mm×130mm试管,每管约4mL。
121℃高压灭菌15 min。斜置试管使成2.5cm高层和4 cm长的斜面。
  制成的培养基为透明、草绿色,接种后于25℃培养24±2h,阴性反应者观察4d。阳性
反应者斜面变为蓝色,阴性反应则颜色不变。
6.10 5g/L氢氧化钾溶液
6.10.1 标准溶液
  称取40 g氢氧化钾,溶于经121℃高压灭菌30 min的5g/L氯化钠溶液中,使成400g/L
氢氧化钾标准溶液,于4 ℃保存备用。
6.10.2 取1mL400g/L氢氧化钾标准溶液,加入经121℃高压灭菌30 min的79mL5g/L氯化
钠水溶液中,分装于已灭菌的18mm×180mm试管中,每管9mL,此溶液应用前新鲜配制。
6.11 “O”因子血清。
 
附 录 A
食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序
(补充件)

┏━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 25g 样品剪碎 (或均质)    ┃ 
┗━━━━━━━┯━━━━━━━┛
        ↓ 
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 225mL改良的磷酸盐缓冲液振荡25℃, 48±2h ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
           ↓ 移入1mL
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 9mL 5g/L氢氧化钾溶液25℃, 0.5min    ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
           ↓ 移入2mL
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 8mL改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤25℃, 4~6h┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
           ↓ 
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃       含吐温80的麦康凯琼脂 含吐温80的亚硫酸铋琼脂 ┃
┃           25℃, 48±2h 25℃, 3~4d      ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━┛
               ↓ 
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃改良的双糖铁琼脂25℃, 24±2h       ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
           ↓ 
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ Rustigian氏尿素25℃, 4h         ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
           ↓ 
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 鸟氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶试验 蔗糖、山梨醇、鼠李糖、阿拉伯糖、 ┃
┃ 25℃, 24~30h 枸橼酸盐25℃, 1~4d               ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
               ↓ 
┏━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 血清学试验        ┃
┗━━━━━┯━━━━━━━┛
      ↓ 
┏━━━━━━━━━┓
┃ 报告结果     ┃
┗━━━━━━━━━┛

━━━━━━━━━━━
附加说明:
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局起草。
本标准主要起草人齐素瑛、郝士海。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施
 

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